JEL ELEKTROFOREZ YÖNTEMİ

JEL ELEKTROFOREZİ

     Elektroforez, DNA gibi yüklü molekülleri boyutlarına göre ayırmak için laboratuvarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Jel elektroforezi, DNA, RNA ve proteinler gibi yüklü molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Üzerinden bir elektrik akımı geçtiğinde, yüklü moleküller bir jel içerisinde hareket eder. Jelin bir ucunun pozitif, diğer ucunun negatif yüklü olması için jel boyunca bir elektrik akımı uygulanır. Yüklü moleküllerin hareketine göç denir. Moleküller zıt yüke doğru hareket eder. Negatif yüklü bir molekül bu nedenle pozitif uca doğru çekilecektir (zıt kutuplar birbirini çeker!). Jel, içinden bir elektrik akımı geçirildiğinde moleküllerin geçebileceği, biraz elek gibi geçirgen bir matristen oluşur. Daha küçük moleküller jelden daha hızlı göç ederler ve bu nedenle daha yavaş göç eden ve dolayısıyla daha kısa bir mesafe kat eden daha büyük parçalardan daha uzağa giderler. Sonuç olarak, moleküller büyüklüklerine göre ayrılır.

Jel elektroforezi ve DNA;

• Elektroforez, farklı uzunluklardaki DNA parçalarını ayırt etmenizi sağlar.
• DNA negatif yüklüdür, bu nedenle jele bir elektrik akımı uygulandığında, DNA pozitif yüklü elektrota doğru göç edecektir.
• Daha kısa DNA dizileri jel içinde daha uzun zincirlere göre daha hızlı hareket eder ve bu da parçaların büyüklük sırasına göre düzenlenmesine neden olur.
• Boyaların kullanımı, floresan etiketler veya radyoaktif etiketler, jel üzerindeki DNA’nın ayrıldıktan sonra görülmesini sağlar. DNA’lar bu boyalar sayesinde jel üzerinde bantlar olarak görüneceklerdir.
• Bilinen uzunluklarda parçalara sahip bir DNA markörü genellikle jelden numunelerle aynı zamanda geçirilir.
• DNA örneklerinin bantlarını DNA işaretçisinden gelen bantlarla karşılaştırarak, örneklerdeki DNA parçalarının yaklaşık uzunluğunu hesaplayabilirsiniz.

Jel elektroforezi nasıl yapılır?

Jelin hazırlanması;

• Agaroz jel DNA parçalarını görselleştirmek için kullanılır. Jel yapmak için kullanılan agaroz konsantrasyonu, üzerinde çalıştığınız DNA parçalarının boyutuna bağlıdır.
• Agaroz konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, matris o kadar yoğun olur ve bunun tersi de geçerlidir. Daha küçük DNA parçaları, daha yüksek agaroz konsantrasyonlarında ayrılırken, daha büyük moleküller daha düşük bir agaroz konsantrasyonu gerektirir.
• Jel yapmak için, agaroz tozu bir elektroforez tamponu ile karıştırılır ve agaroz tozunun tamamı eriyene kadar yüksek bir sıcaklığa ısıtılır.
• Erimiş jel daha sonra bir jel döküm tepsisine dökülür ve numunenin pipetlenmesi için kuyular oluşturmak üzere bir uca bir “tarak” yerleştirilir.
• Jel soğuduktan ve katılaştıktan sonra (artık şeffaf değil opak olacaktır) tarak çıkarılır. Bunun yerine bir diğer tercih hazır jellerdir. Neredeyse artık birçok laboratuvar önceden hazırlanmış jeller kullanıyor.
• Jel daha sonra bir elektroforez tankına yerleştirilir ve elektroforez tamponu jelin yüzeyi kaplanana kadar tanka dökülür. Tampon elektrik akımını iletir. Kullanılan tampon tipi, numunedeki DNA parçalarının yaklaşık boyutuna bağlıdır.

DNA’nın elektroforez için hazırlanması;

• Elektroforezden önce, numunenin kuyulardan dışarı çıkmasını önleyecek viskozitesini arttırmak ve numunenin jel içinden migrasyonunun görülebilmesi için DNA numunesine bir boya eklenir.
• Jelin ilk kuyucuğuna bir DNA markörü (boyut standardı veya DNA merdiveni olarak da bilinir) yüklenir. İşaretleyicideki fragmanlar bilinen bir uzunluğa sahiptir, bu nedenle numunelerdeki fragmanların boyutunun yaklaşık olarak tahmin edilmesine yardımcı olmak için kullanılabilir.
• Hazırlanan DNA örnekleri daha sonra jelin kalan kuyularına pipetlenir.
• Bu yapıldığında, jelin ve pozitif ve negatif elektrotların yönünün doğru olduğundan emin olmak için elektroforez tankının üzerine kapak yerleştirilir (DNA’nın jel boyunca pozitif uca göç etmesini istiyoruz).

Parçaları ayırma;

• Daha sonra elektrik akımı açılır, böylece negatif yüklü DNA jel boyunca jelin pozitif tarafına doğru hareket eder.
• Daha kısa DNA uzunlukları, daha uzun uzunluklardan daha hızlı hareket eder, bu nedenle akımın çalıştığı süre içinde daha fazla hareket etmiş olurlar.
• DNA’nın jel içinde göç ettiği mesafe, yükleme tamponu boyasının göçü izlenerek görsel olarak değerlendirilebilir.
• Elektrik akımı, DNA parçalarının jel boyunca onları ayıracak kadar hareket etmesini sağlayacak kadar uzun süre açık bırakılır, ancak jelin ucundan akıp gidecek kadar uzun sürmez. Bu sürenin optimizasyonu önemlidir. aksi durumda iyi bir yürütme işleminden bahsedilemez.